Test d'immuno-absorption enzymatique (ELISA)

Le test d'immuno-absorption enzymatique (ELISA) peut permettre d'obtenir une analyse utile de la concentration en antigènes ou en anticorps. Un test ELISA type se déroule en cinq étapes :

• 1) Recouvrir les puits d'une plaque de microtitrage d'un antigène.
• 2) Bloquer tous les sites non liés pour empêcher les faux positifs.
• 3) Ajouter un anticorps dans le puits.
• 4) Pour les méthodes indirectes : ajouter un anticorps secondaire conjugué à une enzyme.
• 5) Réaction d'un substrat avec l'enzyme pour générer un produit coloré, preuve d'une réaction positive. Le test ELISA peut être réalisé sur un plan qualitatif ou quantitatif.

En résumé

L'un des principaux avantages du test ELISA est que les résultats sont quantifiables. La réalisation d'un test ELISA nécessite au miminum un anticorps pour détecter un antigène donné ou la présence d'un autre anticorps. L'échantillon dont la concentration en antigènes est inconnue est immobilisé sur un support solide. L' detection antibody est ensuite ajouté pour former un complexe avec l'antigène. Cet anticorps est lié à une enzyme, et, lors de la dernière étape, l'ajout d'une substance, l'enzyme peut convertir cette substance en un signal détectable. Au lieu d'utiliser des matériels radioactifs, qui ont été employés à grande échelle aux débuts de la biologie moléculaire, pour déterminer les résultats d'un test, le test ELISA utilise des enzymes qui réagissent avec les anticorps pour former des produits colorés. Le développement de la couleur dans un test ELISA indique un résultat positif. Cette méthode a deux variantes : Le test ELISA peut être utilisé pour détecter la présence d'antigènes qui sont reconnus par un anticorps (méthode directe) ou il peut être employé pour rechercher les anticorps qui reconnaissent un antigène donné (méthode indirecte).

Test ELISA direct

Comme résumé plus haut, dans le cadre d'un test ELISA direct, le marquage se fait sur l'anticorps lui-même. Des plaques de microtitrage sont enduites d'un échantillon contenant l'antigène cible. La liaison d'un anticorps marqué peut être quantifiée. L'avantage réside dans le fait que le test ELISA direct est relativement rapide du fait qu'un seul anticorps est appliqué. Il permet également d'éviter les éventuels problèmes de réactivité croisée d'un anticorps secondaire avec des composants de l'échantillon d'antigène. Néanmoins, le test ELISA direct requiert le marquage de chaque anticorps primaire, ce qui peut demander du temps et être plus onéreux que dans le cadre des méthodes indirectes. De plus, certains anticorps peuvent ne pas être appropriés au marquage direct. Autre inconvénient de ce test : les méthodes directes ne permettent pas d'amplifier le signal, contrairement aux méthodes utilisant un secondary antibody.

Test ELISA indirect

Le test ELISA indirect est une méthode en deux étapes utilisant un anticorps secondaire marqué pour la détection. Pour commencer, un anticorps primaire est incubé avec l'antigène. Ensuite, un secondary antibody marqué reconnaissant l'anticorps primaire est ajouté. L'un des inconvénients de ce test ELISA indirect réside dans la survenue de réactions croisées pouvant entraîner de forts signaux de fond. En revanche, l'amplification du signal due à l'utilisation d'secondary antibodies permet d'améliorer la force du signal. Plus important encore, la polyvalence est fortement améliorée. Le même anticorps primaire peut être utilisé avec des secondary antibodies anticorps marqués différemment.

Test ELISA sandwich

Le test ELISA sandwich permet d'évaluer la quantité d'antigènes entre deux couches d'anticorps. Les tests sandwich sont limités car les antigènes à évaluer doivent contenir au moins deux sites antigéniques du fait qu'un minimum de deux anticorps réagissent dans le sandwich. Les tests ELISA sandwich sont particulièrement utiles si la concentration d'antigènes est faible ou si les antigènes sont inclus dans un mélange composé de fortes concentrations de protéines contaminantes.

Pour utiliser ce dosage, un anticorps (l'capture antibody) est lié à un puits de la plaque de microtitrage. Un antigène est ensuite ajouté et lié à l'anticorps. Les produits non liés sont ensuite retirés, et un secondary antibody marqué (l'detection antibody) est ajouté, pour finir de compléter le « sandwich ». Le dosage est ensuite quantifié en mesurant la quantité d'secondary antibody marqué (le 3e anticorps) à l'aide d'un substrat colorimétrique. Les principaux avantages de cette technique sont que l'antigène n'a pas besoin d'être purifié avant d'être utilisé en raison de sa spécificité élevée. Son inconvénient : tous les anticorps ne peuvent pas être utilisés.

Test ELISA compétitif

Un anticorps primaire non marqué est enduit sur les puits d'une plaque de microtitrage en contenant 96. L'anticorps primaire est ensuite incubé avec des étalons non marqués et des échantillons dont on ne connaît pas la teneur en protéines. Après avoir laissé cette réaction atteindre un équilibre, on ajoute un antigène conjugué ou un anticorps lié à une enzyme. Ce conjugué va se lier à l'anticorps primaire à la condition que ses sites de liaison ne soient pas déjà pris par un antigène non marqué. Par conséquent, plus l'échantillon ou l'étalon compte d'antigènes non marqués, moins les liaisons à l'antigène conjugué seront nombreuses. Un changement de substrat et de couleur est alors mesuré.

L'avantage du test ELISA compétitif est qu'il est possible d'utiliser des anticorps primaires non purifiés. Dans le cadre d'un test ELISA compétitif, on assiste à une inversion de la relation entre le signal obtenu et la concentration de la protéine cible dans l'échantillon ; en d'autres termes, plus il y a de protéines cibles, moins fort est le signal.

Quantification du signal

Une fois l'anticorps ou les anticorps liés, un réactif généralement transparent est ajouté. L'enzyme conjuguée à l'anticorps clive le réactif et une réaction colorimétrique se produit. Même une infime quantité d'enzyme liée suffit à cliver intégralement le réactif si on lui en laisse le temps ; c'est pourquoi il est important de mettre fin à la réaction, généralement en ajoutant une substance faiblement acide. Dans le cas contraire, tous les échantillons auraient la même densité optique et deviendraient impossibles à distinguer. Après avoir interrompu la réaction suite à l'obtention d'un contraste optimal, l'analyse photométrique permet d'accéder à des résultats quantifiables.

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