Essai de ligature de proximité : Une technique protéomique simple pour identifier les interactions entre protéines

Des molécules A et B peuvent-elles interagir ?

C'est une question très simple qui, dans certains cas, peut représenter un défi significatif au biologiste cellulaire. Les méthodes traditionnelles pour identifier les interactions entre protéines incluent un grand nombre d'expériences complexes comme les tests double-hybrides et les co-immunoprécipitations. Bien que ces expériences permettent d'analyser l'interaction, elles ne sont pas sans comporter plusieurs limitations inhérentes et bien connues.

Par exemple, les tests doubles-hybrides nécessitent généralement l'expression exogène des protéines de fusion cibles et identifient l'interaction dans des conditions artificielles seulement. En revanche, la co-immunoprécipitation, réalisée in vitro, peut être utilisée pour identifier l'interaction entre les protéines natives exprimées de manière endogène (à condition qu’un anticorps soit disponible), mais nécessite une concentration modérée à élevée des deux protéines cibles afin de produire un résultat efficace.

L'essai de ligature de proximité (PLA) est un autre outil in situ simple et sensible dans la boîte à outils du chercheur ; il peut aider à comprendre les interactions entre protéines.

Qu'est-ce qu'un essai de ligature de proximité ?

Un essai de ligature de proximité est un mariage in situ entre les techniques protéomiques traditionnelles basées sur l'affinité des anticorps et la biologie moléculaire moderne.

Dans un essai de ligature de proximité :

• Une paire d'anticorps reconnaissent et se lient à deux cibles susceptibles d'interagir avec elles.
• Ces anticorps sont conjugués à une paire assortie (marquée +/-) d'oligonucléotides à brin unique court.
• Si les deux cibles respectives interagissent, et demeurent donc à proximité étroite, les sondes oligonucléotidiques s'hybrideront et ligatureront avec deux oligonucléotides connecteurs additionnels pour former une structure circulaire continue d'ADN.
• Les enzymes ADN polymérases amplifieront ces molécules circulaires par un simple et fiable mécanisme d'amplification par cercle roulant.

Le résultat est une molécule d'ADN circulaire fortement amplifiée qui peut être détectée par des procédés fluorescents standard, et qui agit comme marqueur qualitatif de l'interaction entre les deux protéines.

Pourquoi utiliser un PLA ?

Aucune technique pour identifier les interactions entre protéines n'offre un standard de référence absolu, et chaque méthode a ses propres forces et limitations. Les chercheurs qui étudient l'interaction entre protéines réalisent souvent plusieurs expériences contradictoires différentes afin de démontrer la même interaction par des voies multiples.

Le PLA est une option attrayante pour identifier les interactions entre protéines car il est :

• Simple - Les essais de ligature de proximité n'exigent pas des semaines de clonage ou d'optimisation moléculaires pour être configurés et réalisés. Il suffit simplement de disposer de bonnes sondes et de bons anticorps.
• Sensible - Dans un essai de ligature de proximité, la lecture est facilitée par la détection de l'ADN amplifié. La nature exponentielle de l'amplification d'ADN signifie qu'un nombre très limité de molécules interagissantes peut produire un signal optique assez fort et robuste. La sensibilité peut être réglée en modulant les conditions d'amplification (par exemple. en accordant plus de temps pour l'amplification par cercle roulant).
• In situ - Les essais de ligature de proximité sont réalisés directement dans des cellules et des sections de tissu fixes. Les chercheurs peuvent caractériser l'interaction en protéine native, dans des conditions quasi-naturelles. L'essai de ligature de proximité n'exige pas du chercheur la destruction des cellules ou l'extraction du contenu protéinique du tissu pour identifier des interactions entre protéines; d'autres étiquettes et marqueurs peuvent donc être utilisés dans la même essai pour identifier d'autres variables simultanément.

Conclusion

L'essai de ligature de proximité est une méthode simple et qualitative pour identifier in situ les interactions entre protéines. L'essai a été également coopté pour identifier des modifications post-traductionnelles comme la phosphorylation. Bien optimisé, avec une bonne compréhension de ses points forts et de ses limites, le PLA fournit un outil supplémentaire puissant au chercheur qui souhaite œuvrer pour une compréhension plus complète de la dynamique cellulaire et de l'interaction protéinique.